論文導讀

口蹄疫（FMD）是由口蹄疫病毒（FMDV）引起的一種急性、高度傳染性的動物疾病，主要影響偶蹄動物，對農業(yè)發(fā)展造成嚴重影響。FMDV 屬于小核糖核酸病毒科的阿夫薩病毒屬，具有七個不同的血清型，且不同血清型之間沒有交叉保護，這給疫苗開發(fā)帶來了巨大挑戰(zhàn)。盡管已有研究探討了FMDV與宿主自噬作用的關系，但FMDV與非典型自噬之間的相互作用尚不明確。特別是，ATG16L1的WD40結構域在非典型自噬過程中對LC3的招募至關重要，但其在FMDV復制中的作用尚未被充分研究。

2024年8月23日，甘肅農業(yè)大學＆蘭獸研在BMC Genomics在線發(fā)表了題為“Knockout of the WD40 domain of ATG16L1 enhances foot and mouth disease virus replication”的最新研究成果。該研究旨在通過CRISPR/Cas9技術敲除PK15細胞中的WD40結構域，以探討非典型自噬對FMDV復制的影響，進而為理解病毒-宿主相互作用提供新的視角，并為防治口蹄疫提供潛在的策略。

主要研究結果

本研究中，通過CRISPR/Cas9技術成功構建了WD40結構域敲除的PK15細胞系（WD40-KO-PK15），并通過基因組測序和Western blotting驗證了WD40基因的成功敲除。實驗觀察顯示，WD40基因敲除并未影響細胞的正常生長，細胞的生長曲線與野生型PK15細胞（WT-PK15）相同。此外，通過光學顯微鏡觀察和核型分析，WD40-KO-PK15細胞在形態(tài)和染色體結構或數量上與WT-PK15細胞沒有顯著差異。這些結果表明，WD40基因敲除的細胞系在形態(tài)和染色體水平上保持穩(wěn)定，為后續(xù)研究FMDV復制的影響提供了可靠的細胞模型。

圖1.PK 15細胞敲除WD40的鑒定

圖2.細胞形態(tài)分析

2.WD 40敲除增強FMD復制

在本研究中，通過觀察細胞病變效應（CPE）來評估WD40敲除對FMDV復制的影響。WD40-KO-PK15細胞與WT-PK15細胞相比，在感染FMDV后展現出更明顯的CPE，且WD40-KO-PK15細胞中FMDV陽性細胞的數量是WT-PK15細胞的2.5倍。進一步的實驗表明，WD40-KO-PK15細胞中FMDV的VP1蛋白和LC3 II的表達增加，病毒mRNA水平和病毒滴度也顯著高于WT-PK15細胞。此外，通過RNA干擾技術敲低WD40后，PK15細胞中FMDV的復制同樣增強。這些結果表明，WD40的缺失或抑制顯著促進了FMDV在PK15細胞中的復制，揭示了WD40在宿主抗病毒反應中的潛在作用。

圖3.口蹄疫病毒的生長特征

圖4.WD 40敲除增強FMD復制

圖5.通過SiRNA敲除WD 40顯著增強了FMDV在PK-15細胞中的復制

3.WT-PK 15和WD 40-KO-PK 15在FMTD感染下的基因表達差異

在本研究中，通過比較WT-PK15細胞和WD40-KO-PK15細胞在FMDV感染后的基因表達差異，共鑒定出3982個差異表達基因（DEGs）。其中，1809個基因在WD40-KO-PK15細胞中上調，而2173個基因下調。這些DEGs涉及23個生物學過程和50個信號通路。KEGG分析顯示，與自噬、NOD樣受體信號通路、PI3K-Akt信號通路、RIG-I樣受體信號通路、Toll樣受體信號通路、mTOR信號通路、TNF信號通路、內吞作用和溶酶體等相關的DEGs數量分別為51、24、21、19、18、17、14、10和4個。此外，還涉及了MAPK信號通路、NOD樣受體信號通路和NF-κB信號通路等。通過qRT-PCR驗證了轉錄組分析結果，隨機選擇的與免疫反應相關的基因在FMDV感染的WT-PK15和WD40-KO-PK15細胞中的表達差異與轉錄組分析一致。這些發(fā)現表明，WD40-KO-PK15細胞是研究FMDV感染和宿主抗病毒反應的有效工具。

圖6.WT-PK 15和WD 40-KO-PK 15感染FMD后基因表達差異

圖7.RT-qPCR驗證RN-seq數據

研究總結

本研究通過CRISPR/Cas9技術成功構建了WD40結構域敲除的PK15細胞系（WD40-KO-PK15），并證實了WD40基因的敲除對細胞的正常生長和染色體穩(wěn)定性沒有負面影響。通過對比WD40-KO-PK15細胞和野生型PK15細胞在FMDV感染后的表現，研究發(fā)現WD40基因的敲除顯著增強了FMDV的復制能力，這表明WD40在抑制FMDV復制中發(fā)揮著重要作用。

進一步的基因表達分析揭示了在WD40-KO-PK15細胞中與自噬、免疫反應和信號轉導相關的多個基因表達發(fā)生了顯著變化。這些差異表達基因的鑒定為理解非典型自噬在FMDV感染中的角色提供了新的分子證據，并可能揭示了宿主細胞內抗病毒防御機制的新途徑。

綜上所述，WD40-KO-PK15細胞系的建立不僅為研究FMDV的復制機制提供了一個有價值的模型，而且為開發(fā)針對口蹄疫的新型預防和治療策略奠定了基礎。這些發(fā)現強調了非典型自噬在病毒感染中的重要性，并可能有助于設計針對FMDV及其他病毒性疾病的干預措施。

https://doi.org/10.1186/s12864-024-10703-6